引言

琼枝(Betaphycus gelatinae)属于红藻门，杉藻目，红翎菜科，琼枝藻属(Doty and Norris, 1985)。琼枝具不规则的羽枝，分枝可对生，互生，向四面伸展(匡梅等, 1999)。藻体表面多现紫红色或黄绿色，腹面大部分为紫红色。琼枝具有食用及药用价值，是生产卡拉胶的重要热带养殖经济红藻。在国外主要分布在菲律宾东部、日本琉球冲绳、印尼、澳大利亚，在我国海南岛沿岸都有分布。

EST-SSR是基于SSR发展起来的一种新型分子标记技术，反应了基因表达的转录部分。在藻类领域中，EST-SSR技术已经被应用于浒苔属海藻(张磊, 2012)、坛紫菜(杨惠等, 2009)、大叶藻(孙典荣等, 2013)和条斑紫菜(刘必谦等, 2009)的遗传差异研究。琼枝的相关研究主要集中在养殖(方哲和鲍时翔, 2008)及生理方面(郑淑贞, 1991)的研究，对琼枝的分子方面的研究报道比较少。文章利用EST-SSR技术对海南岛麒麟菜保护区4个不同地理上的琼枝群体遗传结构进行研究，以期对保护区琼枝现状的评价、管理和保护利用提供有意义的遗传背景数据。

1结果与分析

1.1 4株琼枝基因组DNA扩增结果

试验用5个引物将琼枝基因组DNA进行PCR扩增后，将PCR产物用3%的琼脂糖凝胶电泳并于凝胶成像系统下拍照，得到了扩增结果(图1)。

1.2聚类图分析

电泳图中，出现电泳条带的记为1，否则记为0，将电泳结果转换成0、1矩阵后，用ntsys2.0软件分析相似性系数并做树状聚类图，得到了结果(图2)。

从聚类图可以看出，在阀值为0.61处，所有琼枝以海域为单位聚为4类；在阀值分别在0.64、0.78、0.80和0.81处，潮滩鼻、铜鼓岭、三更峙和欧村的琼枝群体出现分类单元；随着阀值的增大，4个海域的琼枝麒麟菜的分类单元越多，但潮滩鼻海域的琼枝群体分类单元明显其它海域的琼枝群体要出现得更早，遗传相似性系数比另外3个琼枝群体要低。

1.3群体间的分化

总群体的近交系数(Fst)、群体内近交系数(Fis)、遗传分化系数(Fst)是反应各亚群间遗传分化的重要指标，Fst值越大，各亚群间遗传分化越大(Cockerham andWeir, 1993)。我们可以看到遗传分化系数Fst在0.030 7到1.000 0之间(表1)，平均值为0.203 9，即平均有20.39%的遗传变异存在于群体之间，有79.61%的遗传变异存在于群体之内。P4、P5座位的基因流较大，Nm值在1以上，平均Nm值为0.976 3，小于1，说明群体间存在一定的基因流动。

从表中可以看到琼枝群体的平均基因杂合度(Ave_Het)为0.489 1(表2)。总体期望杂合度(Exp_Het*)为0.532 0，不同琼枝群体的变化范围为0.423 4 到0.660 0之间，其中欧村的期望杂合度最低，三更峙的期望杂合度最高。观察杂合度(Obs_Het)平均值为0.623 3，4个琼枝群体的范围在0.396 4 到0.744 4之间，铜鼓岭群体和潮滩鼻群体的观察杂合度接近，在4个群体中比较大，欧村的观察杂合度最低。

有效等位基因数、Shannon's信息指数能反应遗传多样性。可以看到4个琼枝群体检测出的有效等位基因数为1.949 9 到2.566 0之间(表3)，平均为2.228 0个；观察等位基因数在2.4个到3个之间，平均为2.687 5个；潮滩鼻琼枝群体Shannon's信息指数最大，为0.989 6，最小的为欧村琼枝群体，为0.663 8。说明潮滩鼻的遗传多样性最大，欧村的遗传多样性最小。

2讨论

本实验对4个海域的琼枝群体进行了遗传结构分析，结果显示，4个琼枝群体的观察杂合度、期望杂合度、遗传分化系数、观察等位基因数目、有效等位基因数目、Shannon's信息指数都有不同程度的差异，保护区内琼枝群体遗传多样性呈现一定的差异。杨文杰 (2012)对野生与养殖琼枝的EST-SSR分析显示，同一海域的琼枝群体基本无差异，与本文研究结果不同，分析原因是杨文杰在每个海域所取的样本量只有2~4株，而且有部分是进行无性繁殖的养殖琼枝，造成群体内无差异结果的可能性较大。

Alpert等(1993)在研究Frogaria chiloensis种群间的遗传分化时发现，遗传距离与种群间的空间距离高度相关，本文对不同地理的琼枝群体分析表明，同一海域的琼枝样品聚类到一起，且遗传差异由南向北逐渐增大的趋势，地理位置距离越大的点，在遗传差异性上也越大，与Alpert的研究相似。琼枝遗传差异可能与所处的海洋环境有关，张钰(2012)对保护区内生态环境调查显示，在保护区内，由南向北，人类活动逐渐减少，对琼枝的生境破坏程度减少。由于环境的破坏，导致琼枝种质资源下降，遗传差异减小。因而，保护区内琼枝的遗传差异呈现由南向北逐渐增加的趋势。

群体间的分化水平高低与基因流密切相关，Wright (1931)认为基因流指数Nm＞1，基因流能防止不同地区亚群体间发生遗传分化，当Nm＜1，各亚群基因流受阻，群体可能出现遗传分化，本研究中，Nm平均值为0.976 2，说明保护区内琼枝群体出现遗传分化现象；遗传分化系数Fst 能反应群体间遗传分化程度，当0＜Fst＜0.05时，不存在分化；0.05＜Fst＜0.15时，中度分化；0.15＜Fst＜0.25时，高度分化(Wright, 1978)，实验结果显示Fst 平均值为0.203 9，即有20.39%的变异来至于群体间，各群体的遗传分化程度较高，与本研究基因流显示群体出现遗传分化的结果一致。Fis、Fit的值为正值时，群体近交程度严重，Fis、Fit的值为负值时，群体观察杂合度大于期望杂合度，则群体趋向远交，杂合比例增大(Weir and Cockerham, 1984)，本文研究的Fst、Fit的平均值都为负值，群体平均观察杂合度大于平均期望杂合度，说明琼枝群内杂合体较多，基因交流频繁，麒麟菜保护区内琼枝有性繁殖比无性繁殖普遍。

3材料与方法

3.1实验材料

实验材料取自海南省麒麟菜保护区，由北向南分别是文昌潮滩鼻、文昌铜鼓岭、琼海三更寺及琼海欧村四个海域。每个海域采样后，用清水漂洗样品，去除附着的海水及杂质。然后在每个海域的样品中各随机选出9株藻体，共选取了36株藻株进行EST-SSR研究。所选的材料经液氮冷冻后，在-70℃条件下保存，以备DNA提取。

3.2方法

3.2.1基因组的提取

采用上海泛柯生物科技有限公司生产的DNA基因组提取试剂盒(HP Plant DNA Kit D2485-01)按照说明书稍作修改后，进行琼枝基因组DNA的提取。步骤如下：取100 mg研磨成粉末的样品于1.5 mL的离心管中，加入500 μL Buffer CPL，65℃水浴15 min后，加500 μL氯仿/ 异戊醇(24:1)快速混匀30 s，10 000 g离心1 min 后吸取300 μL 上清液到套有收集管的硅胶柱中，再加入150 μL Buffer CXD和300 μL无水乙醇，混匀后10 000 g离心1 min，将硅胶柱换装到另一个收集管中，加入650 μL SPW进行洗涤，10 000 g 离心1 min后将硅胶柱转移到一个新的1.5 mL离心管中，加入50~100 μL的Elution Buffer，65℃水浴3 min，10 000 g离心1 min，离心管中所得的液体即为基因组DNA提取液。

3.2.2PCR扩增

本文所用5条引物序列为：

1：5'-AATGTTCGACGATCTCA-3'，

5'-CTCTTATGCGGCCAAGTA-3'；

2：5'-ATGTCGCCAGGCAGTCAG-3'，

5'-CCAACACGCCCAT CCATC-3'；

3：5'-ATGTCGCCAGGCAGTCAG-3'，

5'-GCTTGGCTGAGCTACACG-3'；

4：5'-TCGGAGTTGGGTTGTGAT-3'，

5'-GAAAGGCAGCCAGAGCAT-3'；

5：5'-CTTTGCTTGCTGGGCTGAC-3'，

5'-GGGAACAATGGACGAGGC-3'。

PCR条件参考赵素芬等(2008)研究与琼枝同科的卡帕藻属的条件并做简单修改，反应总体系为20 μL，其中10 μL 2×PCRMix、1 μL模板、Primer-F和Primer-R引物各1 μL，剩下加入超纯水补足体积至20 μL。PCR扩增条件为：94℃预变性5 min，之后进行30个循环，每个循环94℃变性45 s，46~55℃退火45 s， 72℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min，4℃保存。取5 μL PCR 产物与1 μL上样缓冲液混匀后，在100 V电压下3%琼脂糖凝胶电泳电泳50 min 后，在凝胶成像系统下拍照保存。

3.2.3数据处理

用POPGENE软件(Yeh et al., 1999)计算观察杂合度、期望杂合度、遗传分化系数、观察等位基因数目、有效等位基因数目和Shannon's信息指数等参数，并用ntsys2.0软件作聚类分析。

作者贡献

胡吟胜是试验主要完成人，参与前期引物的筛选、DNA 的提取、PCR 及数据分析，论文的撰写；杨文杰参与引物的设计及前期试验指导；于淑楠协助试验的顺利完成；黄勃为指导老师，参与实验过程中的全程指导。

致谢

感谢海洋公益行业科研专项(201105008-7)、中医药行业科研专项(201207002-03)、国家863(2012AA1-0A412-8)、海南大学植物学国家重点学科(071001)、国家自然科技基金项目(41176084)和国家科技支撑计划项目(2009BADB2B0404-02)对本研究的资助；感谢黄勃老师对本研究的指导及关心。

参考文献

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